El citoesqueleto de actina: su importancia en la formación y mantenimiento de los microambientes tisulares
Autor principal: Julio César Flores Preciado
Vol. XVI; nº 5; 204
The actin cytoskeleton: its importance in the formation and maintenance of tissue microenvironments
Fecha de recepción: 02/02/2021
Fecha de aceptación: 05/03/2021
Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XVI. Número 5 – Primera quincena de Marzo de 2021 – Página inicial: Vol. XVI; nº 5; 204
Autores:
Julio César Flores Preciado, Cirujano Dentista, Doctor en Ciencias área biomateriales y biotecnología. Universidad Autónoma de Baja California, México.
Aaron Ríos Rosas, Estudiante de pregrado, Licenciatura en Cirujano Dentista, Universidad Autónoma de Baja California, México.
RESUMEN
Los microfilamentos de actina del citoesqueleto presentes en las células de cultivos obtenidos in vitro les otorgan a estas un dinamismo adaptativo, presentes en el ambiente natural dentro de los tejidos. La célula en el cultivo debe adaptarse y relacionarse exitosamente mediante el correcto manejo de las muestras y la estandarización de las técnicas de identificación, aislamiento y validación. Para el desarrollo de esta investigación se realizaron cultivos celulares primarios y secundarios a partir de pulpa dental mediante la técnica de explantes tisulares, cultivados y monitoreados bajo condiciones controladas, enriquecidos y suplementados con medio de cultivo estandarizado y selectivo. Los ensayos de validación estructural y funcional corresponden a la técnica de inmunomarcaje triple por microscopia confocal giratoria, tanto para la identificación de células mesenquimales como de estructuras intra y extracelulares. Como resultado se obtuvieron células mesenquimales activas en su fase de mitosis con una dinámica de relación y comunicación celular adecuada, expresando actividad nuclear y de componentes del citoesqueleto de actina unidireccionales (fibras de estrés, córtex y microespículas) y multidireccionales (filopodios y lamelipodios) con lo que se confirma el desarrollo de un microambiente celular optimo y se propone el uso de estos complejos celulares para el desarrollo de constructos tisulares evaluados en biomodelos como terapia regenerativa en ingeniería de tejidos.
PALABRAS CLAVE
andamio, células mesenquimales, citoesqueleto, ingeniería de tejidos, inmunomarcaje.
ABSTRACT
The actin microfilaments of the cytoskeleton present in cultured cells obtained in vitro give these cells an adaptive dynamism, present in the natural environment within tissues. The cell in culture must adapt and relate successfully through the correct handling of samples and the standardization of identification, isolation, and validation techniques. For the development of this research, primary and secondary cell cultures were performed from dental pulp using the tissue explant technique, cultured and monitored under controlled conditions, enriched and supplemented with standardized and selective culture medium. Structural and functional validation assays correspond to the triple immunolabeling technique by spinning confocal microscopy, both for the identification of mesenchymal cells and intra- and extracellular structures. As a result, active mesenchymal cells were obtained in their mitosis phase with an adequate relationship dynamics and cell communication, expressing nuclear activity and unidirectional (stress fibers, cortex and microspicules) and multidirectional (filopodia and lamellipodia) actin cytoskeleton components, thus confirming the development of an optimal cellular microenvironment and proposing the use of these cell complexes for the development of tissue constructs evaluated in biomodels as regenerative therapy in tissue engineering.
KEYWORDS
scaffold, mesenchymal cells, cytoskeleton, tissue engineering, immunostaining.
Los autores de este manuscrito declaran que:
Todos ellos han participado en su elaboración y no tienen conflicto de intereses.
La investigación se ha realizado siguiendo las Pautas éticas internacionales para la investigación relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud (OMS) https://cioms.ch/publications/product/pautas-eticas-internacionales-para-la-investigacion-relacionada-con-la-salud-con-seres-humanos/
El manuscrito es original y no contiene plagio.
El manuscrito no ha sido publicado en ningún medio y no está en proceso de revisión en otra revista.
Han obtenido los permisos necesarios para las imágenes y gráficos utilizados.
Han preservado las identidades de los pacientes.
INTRODUCCIÓN
Con el ambiente apropiado la mayoría de las células vegetales y animales pueden mantenerse, multiplicarse e incluso expresar propiedades diferenciadas en una placa de cultivo. Este método permite que se puedan observar mediante microscopía o ser analizados bioquímicamente, así como comprobar los efectos de añadir o retirar diferentes moléculas específicas, como factores de crecimiento, entre otras posibilidades.
El cultivo de tejidos data su inicio en 1907, mediante la experimentación en neurobiología y la denominada hipótesis neural, que estableció que cada fibra nerviosa es la prolongación de una única célula nerviosa. La mayoría de las células para tejido tisular requieren de un sustrato sólido sobre el cual crecer y dividirse. En la actualidad los cultivos celulares suelen llevarse a cabo sobre placas a las que se adhieren, migran y proliferan. Cuando las células se mantienen en cultivo, por regla general conservan su carácter original. Cada tipo de célula parece tener una memoria de su desarrollo y estar fija en su forma especializada, aunque pueden suceder algunas transformaciones limitadas.
La determinación de la viabilidad de las células mantenidas en cultivo constituye un requisito importante antes de que estas células puedan se cultivadas in vivo. En éste sentido, se han descrito diversos métodos y técnicas útiles para la evaluación de la viabilidad de las células, los cuales se pueden utilizar tanto para células de crecimiento primario, así como también a aquellas sometidas a pases sucesivos mediante evaluaciones morfológicas estructurales por medio de técnicas histológicas y de microscopía óptica en ensayos básicos y mediante protocolos de ensayos inmunohistoquímicos e inmunomarcaje apoyados con microscopía especializada confocal y electrónica con aplicaciones biológicas.
El citoesqueleto representa en la célula una red tridimensional de organización estructural de soporte y relación interna y externa. Está conformado por fibras de naturaleza proteica que pueden ser: internas como los microtúbulos (centro-periféricos) y los filamentos intermedios (periférico-centrales) o bien externas como los microfilamentos de actina (corticales o transcelulares), todos ellos con el objetivo principal de establecer relaciones intra y extracelulares mediante la formación de proyecciones1. El citoesqueleto, mediante los microfilamentos de actina, le brinda a la célula un dinamismo adaptativo, ya sea célula-célula; célula-sustrato, o bien, célula-dispositivo de crecimiento (andamio). Además, permite el mantenimiento celular brindando su reorganización en el cultivo y sobre todo le permite relacionarse o interconectarse facilitando su proliferación.
En la mayoría de los tejidos, el citoesqueleto celular sugiere un andamiaje natural esencial para producir la organización celular y en su momento, su regeneración ordenada. Aunque las células aisladas tienen la capacidad para reformar una estructura tisular respectiva, esto lo hacen hasta un punto limitado ya que no tienen organización tisular intrínseca, es decir, con dificultad son capaces de crear un microambiente celular óptimo para su crecimiento, desarrollo y reproducción2. Las células aisladas no pueden trasplantarse en grandes cantidades ya que existen problemas para la difusión de los nutrientes, con este objetivo se intentan sembrar células sobre andamios inertes que sirven de estructura guía del desarrollo tisular. En general un andamio está diseñado para producir una plantilla estructural para la adhesividad y el desarrollo tisular.
METODOLOGÍA
Una vez evaluados los crecimientos celulares en los cultivos primarios por microscopía óptica invertida se procedió al desarrollo de la técnica inmunohistoquímica por inmunomarcaje triple. Esta técnica permite la identificación de células aisladas positivas al reconocimiento estromal al linaje de células mesenquimales, así como también la identificación de componentes estructurales intra y extracelulares, la expresión se establece por la reacción antígeno-anticuerpo en la que un antígeno de superficie membranal presenta una reacción directa e indirecta de un anticuerpo primario policlonal, secundario monoclonal y marcadores o amplificadores de la reacción expresada3.
TÉCNICA DE INMUNOMARCAJE TRIPLE.
Consistió en la identificación de células aisladas y los diferentes componentes celulares, de manera inicial las clonas celulares se crecieron secundariamente en cajas de 24 pocillos durante 3 días, utilizando los siguientes marcadores: anticuerpo primario policlonal STRO-1, anticuerpos secundarios monoclonales, Alexa F594 y Cy5 y los amplificadores fluorescentes vinculina, faloidina y sytox. Posteriormente, se asignó a cada pocillo un ensayo inmunohistoquímico de acuerdo con los anticuerpos y marcadores suplementados, ver tabla no1: técnica de inmunomarcaje, identificación de pocillos (al final del artículo).
Como primer paso de la inmunohistoquímica, se retiró cuidadosamente por aspiración el medio de cultivo, realizándose dos enjuagues con PBS al 1%, continuando con los 3 pasos básicos del marcaje triple: 1) fijación: colocándose 500 µL de formalina neutra al 10% , 20 minutos de reposo y doble enjuague con PBS, 2) permeabilización: colocación de 500 µL de Tritón 100X al 0.1% en PBS, reposo de 20 minutos y enjuague doble con PBS y, 3) bloqueo: adición de 100 µL de albúmina sérica bovina, reposo por 30 minutos para finalmente incubar a 37 oC por 10 minutos. Pasando el tiempo de incubación se atempero la muestra por 5 minutos retirándose la albúmina con enjuague doble de PBS4.
Después del bloqueo, y pasado el segundo enjuague, se colocó el primer anticuerpo en el pozo de control 1, así como 200µL de cada reactivo a los pocillos rotulados, dejando reposar a 4 oC por 12 horas, pasado el tiempo de reposo se enjuagó cuidadosamente con PBS en dos ocasiones.
Posterior al lavado se colocó el segundo anticuerpo en el control 2 y se adicionaron 150 µL del anticuerpo primario en los pocillos rotulados y adicionados con STRO-1 así como 150 µL del anticuerpo secundario en los pocillos rotulados y adicionados con vinculina, la caja se selló y dejo en reposo por 1 hora a 4 oC. Pasado el tiempo de acción se realizó un enjuague doble con PBS e inició con el análisis de resultados por microscopia confocal giratoria.
RESULTADOS
Reconocimiento estromal.
Reconocimiento estromal para células madre mesenquimales por detección del marcador específico STRO-1: POSITIVO, ver imagen no1: reconocimiento estromal positivo (al final del artículo), indicando que las células presentes en los cultivos celulares corresponden a clonas de células madre derivadas de pulpa dental.
Reconocimiento estructural.
Se muestran filopodios o microespículas y fibras de estrés, estructuras transmembranales múltiples asociadas al citoesqueleto de activa cuyo objetivo es establecer un sistema de interacción, adhesión y organización celular (célula-célula)5 propias de los mecanismos de comunicación celular, ver imagen no2: filopodios o microespículas y fibras de estrés (al final del artículo).
Se muestra un complejo asociado de lamelipodios los cuales corresponden a una serie de prolongaciones anchas, transmembranales y multifocales asociadas al citoesqueleto de actina de importancia en las vías de migración y organización celular (célula-célula) y de soporte de crecimiento tisular (célula-matriz tisular-andamio), ver imagen no3: lamelipodios y proyecciones multifocales6 (al final del artículo). El interés de estas proyecciones radica en que su presencia es de importancia en la creación de microambientes celulares adaptativos desarrollados de manera natural en el tejido y de forma artificial en los constructos tisulares.
Se muestra la actividad nuclear, expresando en un corte, la integridad de la membrana y la actividad del contenido genético, lo que indica el estado de condensación óptimo para iniciar la etapa de replicación durante el ciclo de división celular, ver imagen no4: integridad nuclear (al final del artículo).
Se muestra la confluencia del cultivo primario, lo que indica la creación exitosa de un microambiente celular promotor de vías de proliferación, nutrición y comunicación celular, ver imagen no5: grado de confluencia celular (al final del artículo).
Finalmente se observa en un plano tridimensional, grupos de células aisladas, expresando con las diferentes estructuras celulares, su íntima relación, actividad y confluencia, siendo posible establecer que, las células madre obtenidas de pulpa dental de dientes permanentes, son células estromales o progenitoras con capacidad de adaptación y proliferación celular, ver imagen no6: expresión de adaptabilidad y microambiente celular (al final del artículo).
CONCLUSIONES
La finalidad del aislamiento y cultivo de los complejos celulares obtenidos a partir de pulpa dental, es la proliferación de células madre mesenquimales a partir de las muestras cultivadas, capaces de originar nuevas células, todo ello controlado mediante el perfecto y cuidadoso manejo de los cultivos y subcultivos, así como también de la técnica empleada y el control del microambiente celular el cual brinda las condiciones idóneas para la obtención de cultivos altamente confluentes y con células altamente activas. Revisada la información obtenida de los diferentes ensayos destacan los siguientes comentarios:
- Referente al medio de obtención de la muestra:
Las células madre pueden obtenerse también de pulpa dental y otros tejidos orales. Las células madre pulpares, además de ser de fácil obtención en cuanto a la muestra (pieza dental), tienen una técnica de extirpación del tejido muestra (pulpa dental) que es de fácil acceso, gran cantidad de tejido y por ello una cantidad alta de muestra a cultivar, además de que la población en general tiene la posibilidad de ser donante de forma autóloga o bien ligada a la línea familiar directa y en ocasiones indirecta.
- Referente a su capacidad de proliferación y diferenciación:
En cuanto a su proliferación en cultivos, superan en gran medida al resto de fuentes, además de que su carácter de replicación es más elevado y se caracterizan por su capacidad de autorenovación, formadora de colonias y su diferenciación multipotencial.
- Referente a la técnica de identificación estromal y estructural:
Con la corroboración del estudio inmunohistoquímico, es posible determinar que el aislamiento y diferenciación de las células derivadas de extractos pulpares y que expresan marcadores estromales específicos obtenidas para este estudio, se identifican como células madre o troncales. Además, con los marcadores de estructuras u organelos celulares es posible tipificar a las colonias de células obtenidas y aisladas con la característica clonal y metabólica necesaria para proliferar, dividirse y en su caso diferenciarse a un linaje celular específico, con lo cual es posible el continuar con los estudios futuros de esta investigación, referente a la aplicación de la terapia celular asociada a la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.
Anexo
BIBLIOGRAFÍA
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