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Estrategias de desarrollo de antiEGFR capaces de actuar sobre la proteína ASCT2 para inducir apoptosis vía ROS

Estrategias de desarrollo de antiEGFR capaces de actuar sobre la proteína ASCT2 para inducir apoptosis vía ROS

Autor principal: Lucas Sanz Monge

Vol. XIX; nº 3; 96

Development strategies for anti-EGFR drugs ameanable of targeting the ASCT2 protein and induce ROS-mediated apoptosis

Fecha de recepción: 15/01/2024

Fecha de aceptación: 09/02/2024

Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XIX. Número 3 Primera quincena de Febrero de 2024 – Página inicial: Vol. XIX; nº 3; 96

Autores:

Lucas Sanz Monge1, Carlos Nagore González2, Juan Ignacio Gracia García3, Daniel Joaquín Aladrén Gonzalvo4, Inés Vallespí Puyol5, Patricia Arbués Espinosa6, Laura Belenguer Pola7.

1Oncología Médica, Hospital General Universitario de Valencia, Valencia. 2FEA Pediatría, Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza. 3FEA Radiodiagnóstico, Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza. 4FEA Nefrología, Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza. 5Médico de familia Centro de Salud Bombarda, Zaragoza. 6FEA Pediatría, Hospital Comarcal de Inca, Mallorca. 7Médico de Familia en Centro de Salud Delicias Norte, Zaragoza

Resumen:

Proyecto colaborativo que se centra en la activación terapéutica de ASCT2, un transportador glutamínico crucial para el hipermetabolismo proliferativo en células tumorales. Es sumamente notable asociación inherente de ASCT2 con la superfamilia de receptores epidérmicos (EGFR), sobreexpresada en tumores como el cáncer epidermoide de cabeza y cuello. Pretendemos demostrar mediante tecnología in house que la unión de Cetuximab coestimulada por ASCT2, con la apoptosis subsiguiente es regulada por las vías descendentes intracelulares in vitro. Sin embargo, la resistencia intrínseca que surge debido a la endocitosis del receptor EGFR ha supuesto un reto en investigación frente al que se proponen estrategias novedosas para sensibilizar las células tumorales a la apoptosis ROS-mediada en cánceres de cabeza y cuello; con lo que permite centrarse en la resistencia de Cetuximab mediante enfoques oxidativos en modelos celulares.

Palabras clave: Carcinoma escamoso de cabeza y cuello, antiEGFR, proteína ASCT2, apoptosis celular, señal de ROS

Abstract:

Collaborative project focusing on the therapeutic activation of ASCT2, a pivotal glutamine transporter crucial for the proliferative hypermetabolism in tumor cells. The inherent association of ASCT2 with the epidermal growth factor receptor (EGFR) superfamily, overexpressed in tumors like head and neck squamous cell carcinoma, is particularly noteworthy. Our aim is to demonstrate, using in-house technology, that the co-stimulated binding of Cetuximab by ASCT2 leads to subsequent apoptosis, regulated by intracellular downstream pathways in vitro.

However, intrinsic resistance arising from EGFR receptor endocytosis poses a research challenge, prompting novel strategies to sensitize tumor cells to ROS-mediated apoptosis in head and neck cancers. This allows a focused investigation on Cetuximab resistance through oxidative approaches in cellular models.

Keywords: Head and neck squamous carcinoma, antiEGFR therapies, ASCT2 protein, cell apoptosis, ROS signalling

Los autores de este manuscrito declaran que:

Todos ellos han participado en su elaboración y no tienen conflictos de intereses La investigación se ha realizado siguiendo las Pautas éticas internacionales para la

investigación relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud (OMS).

El manuscrito es original y no contiene plagio.

El manuscrito no ha sido publicado en ningún medio y no está en proceso de revisión en otra revista.

Han obtenido los permisos necesarios para las imágenes y gráficos utilizados. Han preservado las identidades de los pacientes.

ANTECEDENTES (RESUMEN):

La activación terapéutica de ASCT2, un transportador glutamínico, juega un rol de vital importancia en la internalización de glutamina en las células tumorales y del resto del cuerpo. Esta internalización es necesaria para poder llevar a cabo los procesos de hipermetabolismo proliferativo que se producen en las neoplasias, y el hecho de que se encuentre de forma ubicua supone un reto intrínseco en sí. En este proyecto se pretenden encontrar vías de activación de ASCT2 puesto que se ha demostrado la asociación de la misma inherementente a la superfamilia de receptores epidérmicos (EGFR). El complejo de EGFR está habitualmente sobreexpresado en tumores como el cáncer epidermoide de cabeza y cuello y, sin ir más lejos se ha demostrado que la unión a ASCT2 puede ser co-estimulada por el anticuerpo Cetuximab, un fármaco ya aprobado para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello metastásico. Hay evidencia preclínica de que Cetuximab regula las vías de secuenciación descendentes sobre ASCT2 y la expresión del mismo puede quedar modulada por la endocitosis del receptor de EGFR, conduciendo a una resistencia intrínseca. La inhibición de ASCT2 por Cetuximab conduce a una disminución de la internalización de glutamina, y en consecuencia una caída drástica de los niveles de glutation intracelulares. De esa manera, las células sensibles a Cetuximab en neoplasias epidermoides de cabeza y cuello inducen la apoptosis celular a través de los complejos reactivos de oxígeno (ROS) formados a consecuencia de estos procesos intracelularmente. En contraste, la inhibición de EGFR por siRNA o la inhibición de la vía de kinasa con Gefitinib, un inhibidor de las kinasas dependientes de EGFR, han sido estrategias inútiles para sensibilizar a las células tumorales a la apoptosis inducida por las especies reactivas de oxígeno. Este trabajo pretende desarrollar una estrategia novedosa como alternativa a la sensibilización de la apoptosis ROS-mediada en cánceres de cabeza y cuello. El desarrollo del concepto se centra a nivel principal en la resistencia de Cetuximab con estrategias oxidativas.

INTRODUCCIÓN

La familia de aminoácidos solubles A1 tipo 5 (SLC1A5) codifica un transportador transmembrana aminoacídico Sodio-dependiente, ASCT2. Este se trata de un transportador de glutamina que juega un rol decisivo en el metabolismo de la glutamina en las células con un metabolismo hiperproliferativo, entre ellas las células cancerígenas. La glutamina no solo se trata de una pieza clave en la síntesis de proteínas sino que se trata de un elemento fundamental de fuente nitrogenada para la formación de bases de purina y pirimidina requeridas para la proliferación ilimitada de células tumorales. La glutamina participa además en otros procesos biológicos cruciales como la glutaminolisis y la síntesis de glutation. Ambas vías desempeñan una función reguladora imprescindible en el metabolismo de la célula neoplásica. ASCT2 de hecho, se ha planteado como una diana interesante en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, a nivel preclínico el objetivo de actuar sobre ASCT2 resulta todo un reto puesto que este sistema transportador se encuentra de forma ubicua en el resto de tejidos del cuerpo humano y de hecho supone de los procesos celulares fisiológicos

Existen estrategias de elevar los niveles de especies reactivas a oxígeno (ROS) a niveles citotóxicos selectivamente en las células tumorales, lo cual puede inducir el proceso de autoapoptosis como forma de terapia celular autorregulada. Esta vía ha sido extensamente estudiada hace ya tiempo, y un ejemplo de esta estrategia es el ácido dicloroacético (DCA), un fármaco aprobado por la FDA que se ha estado utilizando para tratar un trastorno hereditario infantil en niños por más de 30 años. Las especies reactivas a oxígeno (ROS) a nivel intracelular son consecuencia de una fosforilación oxidativa desmedida sobre la mitocondria; el DCA se ha desarrollado como molécula capaz de inducir esos ROS sobre las células oncogénicas a través de la inhibición de la enzima mitocondrial piruvato deshidrogenasa (PDH) tipo kinasa 1 (PDK1). Esta inhibición de la proteína PDK1, a través de la activación de PDH, redirige los depósitos derivados de piruvato hacia la procesos de fosforilación oxidativos a través de la ruta del ácido tricarboxílico, que puede resultar en la sobreproducción de reactivos de oxígeno sobre la mitocondria, y conduciendo inexorablemente a la célula tumoral vía apoptosis. El DCA ha sido investigado en ensayos clínicos como un inhibidor de PDK1 como tratamiento del cáncer. Sin embargo, existe una resistencia intrínseca de las células tumorales a esa apoptosis inducida por ROS que modula de forma negativa la acción antitumoral del fármaco sobre las células neoplásicas.

Alrededor del 90% de los cánceres epidermoides de cabeza y cuello (HNSCCs) expresan altos niveles de factor de crecimiento epidérmico (EGFR). El Cetuximab se trata de un anticuerpo humanizado antiEGFR que bloquea la unión de ligando sobre EGFR y la activación del receptor en las células tumorales. Este fármaco se aprobó por la FDA en el contexto de la enfermedad metastásica asociada a la combinación con quimioterapia convencional o tratamiento radioterápico.

No obstante, existen con frecuencia mutaciones oncogénicas sobre moléculas cruciales que forman parte de la vía reguladora; o a su vez alteraciones que interaccionan de forma cruzada sobre la activación de las kinasas dependiente de EGFR conduciendo a una resistencia intrínseca a Cetuximab. Encontrar la forma de actuar y modular esta ruta supone un reto de mayor envergadura clínica, puesto que la eficacia de Cetuximab en tumores epidermoides cutáneos sensibles o incluso otros tumores está plenamente demostrada.

HIPÓTESIS DE TRABAJO y RESULTADOS

Los escenarios de resistencia a Cetuximab en pacientes con cáncer epidermoide de cabeza y cuello pueden ser revertidos bajo el estudio de las vías metabólicas de oxidación de ROS. Este proceso puede ser comodulado por los procesos de activación de ASCT2. Se pretende buscar las claves del desarrollo celular para caracterizar estas alteraciones y las vías de acceder al mismo para mejorar las opciones terapéuticas en cuanto al tratamiento activo de cancer epidermoide de cabeza y cuello.

ASCT2 es una proteína asociada a EGFR que puede ser co-activada mediante Cetuximab, conduciendo a una sensibilización de las células hacia las especies reactivas de oxígeno (ROS). El diseño de este proyecto se centra en determinar si la posibilidad de comodulación de ASCT2 en medios celulares posteriormente expuestos, basados en los modelos de hibridación parejada, pueden determinar una solución a la resistencia intrínseca al fármaco.

DESARROLLO DEL PROYECTO. (MÉTODOS):

Las líneas celulares tumorales de cáncer de cabeza y cuello se obtendrán de modelos establecidos (principalmente DaDu, HN5, HN30, MDA1986 y TU167). Se pretende el mantenimiento bajo el método desarrollado de Dulbeco modificado por Eagle (DMEM/F12): esto es, enriquecido con cero fetal bovino 10%, 2mM glutamina, 100ud/mL de Penicilina y 100μg/mL de estreptomicina. Las condiciones de la incubadora deben programarse con concentraciones de 5% CO2 y Tª 37ºC.

FÁRMACOS. CONSTRUCCIÓN cDNA, complejos de siRNA y vectorización

El Cetuximab podemos encontrarlo manufacturado y comercializado en su excipiencia más madura, bajo patente de ImClone Systems y Eli Lilly. DCA y otros quimioterápicos pueden ser adquiridos de Sigma-Aldrich Co.

Los complejos oligonucleotídicos de siRNA para PDK1 y EGFR también se pueden adquirir Sigma-Aldrich Co. Se establecen unas secuencias de objetivos de DNA se establecen según unas secuencias establecidas tanto de PDK1, como EGFR basándose en un sistema de pool protoanalizado basado en la técnica de siRNA (desarrollo de Fisher Scientific) que silencia proteínas cluster tipo Rab5/Rab11.

Se propone trasladar los oligonucleótidos de siRNA hacia constructos serificados de cDNA y transferidos a las células diana con los avances más desarrollados en el mercado, que supone la tecnología de Life Tech, la molécula de Lipofectamina 2000. Una vez preparada la estructura genética, la posterior preparación de los lisados celulares se realiza preparación sistemática de hipofracciones que separen las membranas celulares por polarización del sodio, y con la utilización de Western blotting y precipitados de gel de sulfato y poliacrilamida. Planteamos analizar las señales conjugadas mediante kits preparados de quimioinmunoluminscencia (Amersham Biosciences).

DESARROLLO DE ANTICUERPOS

Los anticuerpos secuenciados mediante Western-blot e inmunoprecipitación pueden ser fácilmente conseguidos en el mercado mediante las siguientes casas comerciales: Cell Signal Tech (anticuerpos contra ASCT2 [D7C12], EGFR [D38B1], EGFR-Y1068p, Akt-S473p, el panel total Akt, Ras, PDH, PARP, caspasa-3, y caspase-3 purificada), Santa Cruz Biotechnology (anticuerpos contra ASCT2 [H- 52]), Abcam (anticuerpos contra fracciones polimerizadas de Rab5 and Rab11), Enzo Life Sciences (anticuerpos contra PDK1), Novus Biologicals (anticuerpos contra S293-phosphorylated PDH), y Sigma-Aldrich Co. (anticuerpos contra EGFR [F4] y β-actina).

FRACCIONAMIENTO CITOPLÁSMICO Y DE MEMBRANA

Los esferoides celulares sobre los que poder realizar la liserización conjufada se pueden conseguir mediante kits comercializados de procesos de cadena en frío que contienen un mézclum de 25mM sucrosa, 5mM Tris-HCl y 0.5 mM MgCl2. Tras la incubación sostenida en hielo durante 20minutos, se propondría homogeneizar las células a 40 pulsos en un homogenizador tipo Dounce. La optimización del centrifugado según la tecnología de Dounce, indica una velocidad de 2700rpm durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante implica entonces ser la fracción citoplásmica y el esferoide la fracción de membrana, por lo que es posible la separación de ambos sistemas. Implicaría posteriormente volver a precipitarlo con PBS. Posteriormente se trataría de analizar la fracción citoplásmica y la membrana mediante un análisis de inmunoblotting.

DETECCIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ROS)

 

Podemos detector la señal de ROS intracelular mediante kit preparados para este fin (Enzo Life Sciences), con un proceso de montado y sistematización ya descrito en el envase comercial. En resumen, las células se cultivan en una solución platídica con un ratio de confluencia del 40-60% y posteriormente tratados. Tras el fin del tratamiento, se plantea teñir las células bajo la detección isoplasmática de ROS a 37ºC por 1 hora y después observados mediante microscopia de fluorescencia.

HIBRIDACIÓN DE DOBLE LINKER

 

Para la tecnología de hibridación de doble linker y el desarrollo de cultivos celulares, se debería utilizar una fijación de metanol al 85% con posterior permeabilización al 0.1% de teutronio por 15 minutos. Las células que crecen en comatrices se incuban en una solución covalente que puede conseguirse con un kit de deteción de doble linker cultivado con anticuerpos antiEGFR y antiASCT2, tanto juntos como separadamente a temperatura ambiente durante 2 horas. La unión y los reactivos de ligando pueden visualizarse mediante la especie ratio-específica de

PLA PLUS o PLA MINUS, covaraciones de anticuerpos secundarios también disponibles en el kit de Duolinker, todo ello manufacturado por Enzo Life Sciences-Axxora.

La adición de Glutamina se mide en una suspensión celular de tubo tipo Eppendor tras homotripsinización de las células, suspensión de las mismas en 0.5mL de uun medio deficiente de glutamina que contiene 5 μCi/mL de H-manizada glutamina de laboratorios Perkin Elmer, y cultivada a 37ºC durante 5 minutos. Tras esta incubación, las células pudieron ser centrifugadas y lavadas durante 3 veces con una solución helada de PBS. Posteriormente se busca la lisergización de las células a 200μL con un 0.2% de solución de suero salino enriquecido, y neutralizadas posteriormente con cloruro sódico y analizadas mediante un contador tipo Beckman LS6500.

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