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Herramienta de edición génica CRISPR/Cas: su papel en la terapia génica y su potencial terapéutico para la Distrofia Muscular de Duchenne

Herramienta de edición génica CRISPR/Cas: su papel en la terapia génica y su potencial terapéutico para la Distrofia Muscular de Duchenne

Autora principal: María Paz Alfaro Chan

Vol. XIX; nº 13; 417

CRISPR/Cas gene editing tool: its role in gene therapy and its therapeutic potential for Duchenne Muscular Dystrophy

Fecha de recepción: 16/06/2024

Fecha de aceptación: 11/07/2024

Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XIX. Número 13 Primera quincena de Julio de 2024 – Página inicial: Vol. XIX; nº 13; 417

Autores:

María Paz Alfaro Chan 1, Daniel Ruiz Mairena 2, David Alvarado Chou 3, María José Mora Navarro 4, Ignacio José Silesky Valverde 5, José Pablo González Aguilar 6, Andrés Astorga Sosa 7                   

  1. María Paz Alfaro Chan. Médico General, Investigadora Independiente, San José, Costa Rica. https://orcid.org/0000-0001-9617-1389
  2. Daniel Ruiz Mairena. Médico General, Investigador Independiente, San José, Costa Rica. https://orcid.org/0000-0002-5215-6096
  3. David Alvarado Chou. Médico General, Investigador Independiente, San José, Costa Rica. https://orcid.org/0000-0001-8471-1202
  4. María José Mora Navarro. Médico General, Investigadora Independiente, San José, Costa Rica. https://orcid.org/0009-0002-4499-971X
  5. Ignacio José Silesky Valverde. Médico General, Investigador Independiente, San José, Costa Rica. https://orcid.org/0009-0004-7432-0549
  6. José  Pablo González Aguilar. Médico General, Investigador Independiente, San José, Costa Rica. https://orcid.org/0000-0002-0055-8763
  7. Andrés Astorga Sosa. Médico General, Investigador Independiente, San José, Costa Rica. https://orcid.org/0000-0001-9120-193X

Resumen

Uno de los principales objetivos de las investigaciones actuales en el ámbito de la genética, se centra en el desarrollo de técnicas que permitan editar o corregir con precisión y eficiencia el genoma de células vivas. Entre las distintas herramientas de edición genómica que han surgido, se destaca el sistema CRISPR/Cas9, un mecanismo de defensa bacteriano que ha sido adaptado y rediseñado para su utilización en otros modelos celulares. La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es una de las enfermedades que ha sido foco de investigación, donde en experimentos recientes con CRISPR/Cas9, se han logrado reducir genes que codifican para la función del gen DMD. A pesar de los múltiples avances de esta técnica de edición genética, aún se requiere incrementar su especificidad para eliminar la aparición de mutaciones fuera del gen objetivo.

Palabras clave: CRISPR/Cas, Edición genómica, Terapia génica, Distrofia Muscular de Duchenne.

Siglas: DMD: Distrofia Muscular de Duchenne, CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, DSB: Doble cadena de ADN de extremos romos, NHEJ: Unión de extremos no homólogos, PAM: Motivo adyacente de protoespaciador, AAV: virus adeno asociado, vegrfr2: receptor tipo 2 de factor de crecimiento endotelial vascular, CFTR: regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística.

Abstract

One of the main objectives of current research in the field of genetics focuses on the development of techniques that allow the genome of living cells to be edited or corrected with precision and efficiency. Among the different genome editing tools that have emerged, the CRISPR/Cas9 system stands out, a bacterial defense mechanism that has been adapted and redesigned for use in other cell models. Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is one of the diseases that has been the focus of research, where in recent experiments with CRISPR/Cas9, genes that encode the function of the DMD gene have been reduced. Despite the multiple advances of this gene editing technique, its specificity still needs to be increased to eliminate the appearance of mutations outside the target gene.

Keywords

CRISPR/Cas, Genome editing, Gene therapy, Duchenne Muscular Dystrophy.

Declaración de buenas prácticas clínicas

Los autores de este manuscrito declaran que: Todos ellos han participado en su elaboración y no tienen conflictos de intereses. La investigación se ha realizado siguiendo las pautas éticas internacionales para la investigación relacionada con la salud con seres humanos elaboradas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la Organización Mundial de la Salud (OMS). El manuscrito es original y no contiene plagio. El manuscrito no ha sido publicado en ningún medio y no está en proceso de revisión en otra revista. Han obtenido los permisos necesarios para las imágenes y gráficos utilizados. Han preservado las identidades de los pacientes

Introducción

A partir de la propuesta del modelo tridimensional de la doble hélice por Watson y Crick en 1953, se dio el punto de partida para el desarrollo de múltiples técnicas para la manipulación del material genético, su modificación y expresión.1 2  La terapia génica es una de estas técnicas, la cual se entiende como el tratamiento de enfermedades hereditarias o adquiridas mediante la transferencia de material genético en células del paciente con la finalidad de restablecer una función celular que estaba defectuosa, introducir una nueva función o interferir con una función existente. 1

Una de las técnicas moleculares que han tenido mayor impacto en los últimos años es la herramienta molecular conocida como CRISPR / Cas9.1 CRISPR es la sigla inglesa para “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”, que en español significa repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas.3  Estas siglas son el nombre que recibe un locus (locus = posición del gen u otra secuencia de ADN) del cromosoma bacteriano en donde se encuentran genes, con los cuales se ha creado una poderosa herramienta que permite manipular deliberadamente el ADN de cualquier organismo.4

En la actualidad este sistema se utiliza para cortar zonas de interés del ADN e introducir secuencias deseadas que producirían genotipos o fenotipos deseados.4 A diferencia de otras técnicas, esta permite la edición de forma tan específica de secuencias del ADN del genoma que se podría hacer la comparación a unas “tijeras moleculares” que cortan en puntos determinados e insertan los cambios con exactitud.1 En el campo de la genética médica ha sido de gran relevancia, en especial en enfermedades genéticas como lo es la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).5

Hasta la fecha, no existe una cura definitiva para las distrofias musculares, sin embargo, se han desarrollado diferentes tratamientos para mejorar los síntomas de la enfermedad.5 6 Entre estos encontramos terapias de expresión génica y terapias de reemplazo de genes. Lo anterior se logra al apuntar estratégicamente ciertas secuencias de gen DMD para editar, las secuencias de corte y empalme se pueden alterar o interrumpir para omitir exones. 5 Esta revisión resume los estudios y avances recientes en el campo de la terapia génica que han empleado el sistema CRISPR / Cas9 para el posible tratamiento de la DMD. Dado lo anterior, el objetivo de esta revisión se centra en difundir la importancia de este mecanismo en el campo de la medicina con un enfoque principal en los estudios sobre DMD.

Sistema CRISPR/Cas ¿Cómo Funciona?

La edición del gen CRISPR / Cas9 se adaptó a partir de los mecanismos endógenos de la inmunidad adaptativa bacteriana contra la infección viral.7 Estas bacteria poseen locus CRISPR que contienen tres elementos básicos: la matriz CRISPR, el gen de la enzima Cas9 y el gen tracrRNA (ARN CRISPR trans-activador). La matriz CRISPR se compone de elementos espaciadores y repetidos intercalados entre sí. Los elementos espaciadores se derivan de fragmentos de ADN viral extraño que, por ejemplo, procesa una bacteria tras una infección. 5 8

La transcripción de esta matriz produce ARN pre-CRISPR (pre-crRNA), que luego se hibridan con los tracrRNA producidos a partir de los mismos loci mediante el emparejamiento de bases en los elementos repetidos. Esto inicia el procesamiento enzimático y la maduración de los pre-crRNA en crRNAs.3 4 Estos híbridos tracrRNA-crRNA ahora pueden ser reconocidos y unidos por Cas9, una endonucleasa que induce roturas de doble cadena de ADN de extremos romos (DSB) (ver Figura 1).3 Seguidamente, Cas9 se guía a su objetivo, una secuencia de 20 nucleótidos que debe estar junto a una secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM), en virtud de la complementariedad con el crRNA que porta.3 4 Por tanto, Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por ARN. De esta manera, el ADN extraño procedente de virus infecciosos se degrada eficazmente, evitando el avance de la infección.4

Con la información anterior, es más fácil visualizar cómo se puede adaptar el sistema CRISPR / Cas9 para su uso en la edición precisa de genomas.8 Los ARNg pueden diseñarse para inducir DSB dirigidos en cualquier secuencia de ADN seleccionada tras la administración con Cas9, siempre que la secuencia objetivo esté cerca de un sitio PAM reconocido por la enzima Cas9 utilizada . La mayoría de las veces, este DSB se repara mediante mecanismos de unión de extremos no homólogos (NHEJ), lo que conduce a inserciones y / o deleciones aleatorias (indeles) en el sitio de escisión.4 En experimentos recientes, se han logrado reducir genes que codifican para diferentes enfermedades como la función del gen DMD involucrado en la distrofia muscular de Duchenne.9

Distrofia Muscular de Duchenne

La distrofia muscular de Duchenne es una miopatía hereditaria (congénita) recesiva ligada al cromosoma X, una monosomía debido a una mutación que afecta al gen de DMD (Distrofia Muscular de Duchenne) lo cual causa una disminución de la proteína distrofina que a su vez causa una disrupción del complejo distrofina-glicoproteína, que es importante para la integridad de la membrana del sarcolema.6 Esta alteración genera un daño progresivo en el músculo debido a la disminución de la proteína causando un deterioro muscular progresivo con complicaciones principalmente cardio-respiratorias y pérdida ambulatoria.10 Esta mutación puede ser causada por varios mecanismos principalmente por deleciones, pero además también duplicaciones, inserciones o mutaciones puntuales en el gen de DMD que se dan en las islas CpG de exones que generan un cambio en el marco de lectura por lo cual se produce usualmente un codón de finalización anticipado generando una proteína prematura con ausencia de producción de distrofina.2

Actualmente se utilizan terapias farmacológicas para tratar los síntomas de la enfermedad para mejorar la calidad y aumentar la sobrevida de los pacientes con corticosteroides (Pontevedra & Da Cuña, 2018) como una opción accesible pero no curativa, sin embargo se han propuesto terapias de edición genéticas como CRISPR / Cas9 como herramienta alternativa para el tratamiento de mutaciones que generan patologías como la DMD.9

Influencia del Sistema CRISPR/Cas en el tratamiento de la DMD

Dentro de los tratamientos que se pueden ofrecer para la Distrofia Muscular de Duchenne, los mecanismos de estos se pueden basar en 3 diferentes métodos (ver Figura 2.).4 El primer método estudiado, un ADN guía es usado para generar una escisión dentro o cerca de un codón de terminación, de algún exón mutado de la distrofia muscular de Duchenne, que ciertamente tiene la capacidad de restaurar de forma normal la configuración establecida o eliminar el codón de terminación.4 5 El segundo método, mejor conocido como classical exon skipping, es más bien si el ADN guía se enfoca en realizar escisiones en secuencias splicing de intrones y exones del DMD, con el fin de brincarse el exón alterado y continuar con la secuencia. Y por último, en el que dos ADNs guía permiten la escisión tanto en intrones como exones separados, se consigue que dos o más deleciones de exones puedan ser realizados y restaurar el marco de lectura del DMD. 4

Por otro lado se puede utilizar la herramientas CRISPR / Cas9 para corregir mutación de duplicación en el gen DMD por medio de ARN que permite la deleción de exones duplicados. También es importante mencionar que se pueden editar bases específicas de una secuencia utilizando este sistema, al utilizar una enzima Cas9 con nula actividad catalítica o nucleasas, que permiten hacer cortes en ADN. 4 7

Otro acercamiento terapéutico es la modulación transcripcional con el mismo sistema CRISPR / Cas9 al dirigirse a regiones promotoras del gen que produce utrofina, el cual es un homólogo de la distrofina que se ha demostrado que puede rescatar fenotipos de DMD esto se puede realizar mediante un aumento de la respuesta celular a través de estímulos producido por el aumento de utrofina; utilizando enzimas Cas9 específicas se pueden realizar deleciones de regiones las cuales son el objetivo de ARNs inhibitorios por lo cual al eliminarse estas zonas producen aumento de utrofina porque los ARNs inhibitorios no actúan. 9 10

Otros usos y descubrimientos destacados de CRISPR/cas9 en el campo de la genética médica en la actualidad

A lo largo de esta revisión se ha dado un enfoque específico a la herramienta de edición génica CRISPR/cas como potencial terapia génica para la DMD y sus diferentes mecanismos de acción. Sin embargo, como herramienta en la terapia génica se debe recordar que no es exclusiva para la DMD, sino que existen múltiples investigaciones actuales donde se estudian diferentes enfermedades que son potencialmente modificables a través de estas técnicas. 1

Enfermedades como el osteosarcoma (a través del silenciamiento del gen que codifica para la proteína Cdk11) y la Fibrosis Quística (a través de la modificación del gen que codifica para el receptor CFTR para recuperar el fenotipo normal), se han visto beneficiadas con el sistema CRISPR/cas. 1 Además de las anteriores, al ser un tema tan actual también es controversial y existen múltiples investigaciones que se están realizando en la actualidad que son destacadas.3 Entre estas se pueden encontrar: Virus adeno-asociado (AAV) CRISPR/Cas9 para reducir la expresión de vegrfr2 (receptor tipo 2 de factor de crecimiento endotelial vascular) y bloquear la angiogénesis in vitro, aplicación y optimización de CRISPR / Cas9 mediante ingeniería genética en ajolote (Ambystoma mexicanum), CRISPR / Cas9 en la terapia del cáncer, reducción de la latencia del herpesvirus asociado a Sarcoma de Kaposi, CRISPR / Cas9 como protector de la muerte neuronal en un modelo de la enfermedad de Parkinson. 1 3

Por otra parte, el uso de CRISPR / Cas9 como terapia antiviral es un tema que está en constante actualización. 3 Por ejemplo, uno de los estudios más recientes demuestran su posible utilidad en el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), con el trasplante de células pluripotenciales inducidas de pacientes con mutaciones en el receptor CCR5. 3 Otro de los virus estudiados para ser tratados con esta terapia génica han sido el virus de la hepatitis B (HBV), sin embargo al igual que el VIH, las investigaciones siguen en desarrollo.1

Conclusiones

La terapia génica y las posibilidades que hoy existen de utilizar el sistema CRISPR / Cas9 para la edición genómica y sus múltiples aplicaciones, traen consigo un cambio en la evolución de la genética médica. Enfermedades que por mucho tiempo se habían considerado “sin cura o intratables” ahora tienen la posibilidad de que se desarrolle una posible cura definitiva o por su parte una mejora considerable en la calidad de vida de las personas.

El cáncer y las enfermedades monogénicas, son de las patologías más sometidas a investigación. Como se puede afirmar a partir de esta revisión, la DMD a través de los diferentes métodos del sistema de edición genómica CRISPR / Cas9 permiten editar el gen y así reducir la expresión de éste, lo cual parece prometer una posible solución a lo que se pensó por muchos años ser una enfermedad incurable. A pesar de tener mucha evidencia científica al día de hoy, es un tema que está en constante actualización. Por tanto, aún faltan mayores avances que traigan consigo más y mejores técnicas que puedan alcanzar las metas con respecto a la mejora de la calidad de vida de cientos de miles de pacientes que día con día luchan contra este tipo de patologías.

Ver anexo

Referencias

  1. Mayboca Padilla D, Flores Ruiz D. CRISPR/CAS: EL FUTURO DE LA EDICIÓN GENÉTICA. Epistemus [Internet]. 1 de diciembre de 2020 [citado 3 de junio de 2024];13(27):38-44. Disponible en: https://epistemus.unison.mx/index.php/epistemus/article/view/115
  2. Jorde, L., Carey, J. Bamshad, M. (2020). Biología celular básica: estructura y función de los genes y cromosomas. Genética Médica (6ta ed., pp.6,84,85). Elsevier, Inc.
  3. Martinez-Oliva Brenda Gisela. Crispr, una herramienta para editar genomas. Gac Med Bol  [Internet]. 2020  Dic [citado  2024  Jun  5] ;  43( 2 ): 179-183. Disponible en: http://www.scielo.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1012-29662020000200010&lng=es
  4. Happi Mbakam C, Lamothe G, Tremblay G, Tremblay JP. CRISPR-Cas9 Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Neurotherapeutics. 2022 Feb 14;19(3).
  5. Chemello F, Bassel-Duby R, Olson EN. Correction of muscular dystrophies by CRISPR gene editing. Journal of Clinical Investigation [Internet]. 2020 Jun 1;130(6):2766–76. Available from: https://www.jci.org/articles/view/136873
  6. Villalaz I, Ferdin L, Lara D, Callender E. Distrofia muscular de Duchenne. sc [Internet]. 31 de diciembre de 2023 [citado 10 de mayo de 2024];1(4):333-4. Disponible en: https://revistas.umecit.edu.pa/index.php/sc/article/view/1281
  7. Gabriel, Sergi Sayols, Kotini AG, Heinen S, Möckel MM, Beli P, et al. Linking CRISPR–Cas9 double-strand break profiles to gene editing precision with BreakTag. Nature biotechnology. 2024 May 13.
  8. Liu Q, Yang J, Xing Y, Zhao Y, Liu Y. Development of delivery strategies for CRISPR‐Cas9 genome editing. BMEmat. 2023 May 26;1(3). (WOTJAL).
  9. Choi E, Koo T. CRISPR technologies for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Molecular Therapy [Internet]. 2021 Apr 3;29(11). Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001621001891
  10. Agrawal P, Harish V, Mohd S, Singh SK, Tewari D, Tatiparthi R, et al. Role of CRISPR/Cas9 in the treatment of Duchenne muscular dystrophy and its delivery strategies. Life Sciences [Internet]. 2023 Oct 1;330:122003. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37544379/