Los cultivos tridimensionales: Una innovadora forma de en estudios  in vitro

Los cultivos tridimensionales: Una innovadora forma de en estudios  in vitro

Autora principal: Eva María Valella López

Vol. XV; nº 10; 465

Three-dimensional cultures: An innovative way of in vitro studies

Fecha de recepción: 06/04/2020

Fecha de aceptación: 12/05/2020

Incluido en Revista Electrónica de PortalesMedicos.com Volumen XV. Número 10 –  Segunda quincena de Mayo de 2020 – Página inicial: Vol. XV; nº 10; 465

Autora: Eva María Valella López, Técnico Superior de Laboratorio Clínico y Biomédico en el Hospital Universitario Central de Asturias.

Resumen:

Los cultivos celulares son la forma de desarrollar células procedentes de un organismo vivo de manera in vitro. Estos cultivos celulares intentan recrear de una manera aproximada las reacciones que las células exponen en el interior del cuerpo del animal del que proceden.

Todas las técnicas de cultivo, tanto de tejido como de células in vitro,  hasta hace unos años estaban basadas en cultivos bidimensionales o cultivos 2D. Este tipo de cultivos, han mostrado limitaciones esenciales tales como la imposibilidad de reproducir la morfología y las propiedades bioquímicas que poseen las células en su emplazamiento en el organismo vivo. Para resolver estos y otros problemas de similar naturaleza, se ha propuesto el uso de modelos de cultivo en tres dimensiones (3D), tales como los denominados esferoides y esferas líquidas. Estos son un modelo de cultivo tridimensional, el cual saca partido a la manera natural de agregación que muestran muchos tipos celulares, para crear masas de forma esferoidal, que se cultivan de manera in vitro.

Este tipo de cultivos celulares provocó un gran avance en el campo de la biología molecular y específicamente en el campo de los cultivos celulares, aunque también destacó un avance importante en el campo de la medicina ya que se han utilizado como modelo para gran número de ensayos terapéuticos experimentales.

Palabras clave: cultivo celular, tridimensional, organismo, biología molecular.

ABSTRACT:   

Cell cultures are the way to develop cells from a living organism in vitro. These cell cultures try to recreate in an approximate way the reactions that the cells expose inside the body of the animal from which they come.

All culture techniques, both in tissue and in vitro cells, until a few years ago were based on two-dimensional cultures or 2D cultures. These types of cultures have shown essential limitations such as the impossibility of reproducing the morphology and biochemical properties that the cells possess at their location in the living organism. To solve these and other problems of a similar nature, the use of three-dimensional (3D) culture models, such as so-called spheroids and liquid spheres, has been proposed. These are a three-dimensional culture model, which takes advantage of the natural way of aggregation shown by many cell types, to create spheroidal masses, which are grown in vitro.

This type of cell culture caused a great advance in the field of molecular biology and specifically in the field of cell cultures, although it also highlighted an important advance in the field of medicine since they have been used as a model for a large number of trials experimental therapeutics

Keywords: cell culture, three-dimensional, organism, molecular biology.

INTRODUCCIÓN:

Que son los cultivos celulares:

La técnica del cultivo celular es un proceso a través del cual las células pueden desarrollarse de manera in vitro en unas condiciones de humedad, temperatura, oxígeno y dióxido de carbono controladas.⁽¹⁾ Esta técnica, se usa como referencia al cultivo de células eucariotas pluricelulares aisladas, sobre todo células animales.⁽²⁾ Los cultivos celulares pueden designarse como un sistema formado por células procedentes de un órgano o un tejido que puede ser normal o tumoral, sostenidas mediante medios de cultivo adecuados con una composición determinada. De esta forma puede asegurarse su supervivencia y proliferación, haciendo que sus funciones metabólicas se mantengan de manera semejante a las que tenían en el interior del organismo del que proceden. ^(1,2)

Cuando comenzaron los cultivos in vitro:

El ser humano, siempre ha querido averiguar todas las actividades funcionales de las células en los organismos con vida, por lo que se empezaron a realizar cultivos de las células de estos organismos.⁽¹⁾El comienzo de los cultivos celulares in vitro, datan de hace más de un siglo, cuando en 1885, el biólogo alemán  Wilhelm Roux,  extrajo  células procedentes de una médula de embrión de pollo desarrollándolas  en  un medio compuesto principalmente por una solución salina durante varios días, esta solución es conocida como solución de Ringer , apellido del que fue su creador el fisiólogo inglés Sydney Ringer. Para que el cultivo proliferara de manera adecuada, esta solución salina debía encontrarse a temperatura tibia. ^(1,3) Posteriormente, comprobó que dichas células podían sobrevivir en un entorno controlado reproduciendo las condiciones del interior del organismo del animal del que procedían.⁽³⁾

Hasta 1907, se consideraba el cultivo celular simplemente como un método de estudio del comportamiento celular. ^(3,4)

A partir del inicio de la realización de los cultivos celulares, se originaron varias contingencias procedentes de las siembras primarias. La principal preocupación, era poder llegar a desarrollar un medio de cultivo adaptado para que las células pudieran proliferar de manera adecuada. ⁽⁵⁾ 

En el año 1907, el biólogo y anatomista estadounidense  Ross Granville Harrison, el cual fue considerado el precursor de los cultivos de tejidos animales, empleó  técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, ⁽⁶⁾  realizando la técnica de gota pendiente  mediante una gota de la linfa del animal colgada de un portaobjetos.^(2,3)

Poco tiempo después a estos acontecimientos, en el año 1910, el biólogo Burrows,  observó que introduciendo el tejido en plasma de pollo se conseguía el crecimiento de dicho tejido y por tanto de sus células. ⁽²⁾

En el año 1916 se empleó de manera innovadora los extractos de tripsina para romper las membranas de las células, dando lugar al primer cultivo íntegramente celular funcional. ⁽⁵⁾

Posteriormente, a comienzos del siglo XX, se consiguió prolongar la vida del cultivo celular mediante la realización de subcultivos o pases, esto se refería a realizar trasvases de células de un envase de cultivo a otro u otros tanto con las mismas condiciones como con otras distintas. Uno de los principales problemas que aparecieron eran la multitud de contaminantes que invadían los cultivos, impidiendo el uso de ciertas técnicas. Para resolver este problema, se desarrollaron una serie de procedimientos basados en las condiciones de asepsia. La finalidad de estos procedimientos era mantener las condiciones adecuadas de esterilidad de los cultivos una vez fueran añadidos los pertinentes antibióticos. ^(2,5)

En el año 1949 Alan Parks, expuso un protocolo para congelar células cultivadas, el cual continúa a día de hoy en práctica.

En el año 1952 Gey, Coffman y Kubicek reprodujeron la primera línea celular con células procedentes de un ser humano la cual denominaron Hela, haciendo referencia a las iniciales de la persona de la que procedían, Henrietta Lacks. Estas células procedían de un tumor alojado en la zona del cuello del útero de la mujer. ⁽⁵⁾

Tipos de cultivos celulares:

Los cultivos celulares se desarrollan principalmente a partir de suspensiones celulares producidas a partir de la disgregación de tejidos. ⁽⁶⁾

A la hora de realizar una clasificación de los cultivos celulares podemos toparnos con distintos criterios, aunque principalmente los cultivos de origen animal se pueden clasificar dependiendo de la capacidad de adherencia de las células, si estas proceden directamente del órgano o si han sido modificadas. ⁽⁴⁾

Dentro de los tipos de clasificación de los métodos para cultivo de células tenemos:

Cultivos primarios: son cultivos que se generan a partir de un tejido u órgano, en este tipo de cultivo las células se encuentran vivas y dan lugar a una proliferación limitada. Dentro de los cultivos primarios podemos destacar:

• Cultivo directo de órganos: se realiza con la explantación de un fragmento u órgano pequeño sobre una rejilla. Esta explantación se encuentra mantenido gracias a permanecer cubierto de un medio, el cual, le proporciona los nutrientes adecuados para su desarrollo además de albergar los desechos resultantes de la actividad celular.⁽⁷⁾
• Explantes primarios: se realizan a partir de un fragmento de tejido u órgano sobre un soporte que puede ser de cristal o plástico, las células se pegan a la superficie del soporte consiguiendo producir una migración desde el explante hacia los extremos del soporte, tapizándolo.^(5,8)
• Cultivo celular primario: se generan a partir de explantes primarios o suspensión de células disgregadas obtenidas mediante métodos enzimáticos o mecánicos. En este método de cultivo las células se desarrollan notoriamente. Dentro de este tipo de cultivos podemos destacar otros dos tipos como son cultivos en monocapa o en suspensión.⁽⁸⁾
• Cultivos monocapa: En este cultivo las células forman una sola capa de una célula de espesor. El anclaje de las células al sustrato es un requisito para la proliferación de estas sobre la superficie del recipiente. ⁽⁹⁾ El contacto entre las células da lugar a la detención de manera temporal de la proliferación de estas, hasta el momento en el que se realiza un subcultivo o pase a un recipiente de mayor tamaño y con medio fresco.
• Cultivos en suspensión: En este tipo de cultivos, las células se dispersan por todo el medio de cultivo. A diferencia con el cultivo en monocapa, su crecimiento no depende del anclaje de las células a la superficie del recipiente. Los cultivos en suspensión alcanzan la confluencia en el momento en el que existe un gran número de células y los nutrientes existentes en el medio son insuficientes. Este cultivo está restringido a células hematopoyéticas, células madre, líneas celulares alteradas y células tumorales.⁽⁹⁾

Los cultivos de células tradicionales, en dos dimensiones (2D), han mostrado limitaciones esenciales tales como la imposibilidad de reproducir la morfología y las propiedades bioquímicas que poseen las células en su emplazamiento en el organismo vivo. Para resolver estos y otros problemas de similar naturaleza, se ha propuesto el uso de modelos de cultivo en tres dimensiones (3D), tales como los denominados esferoides y esferas líquidas. ⁽¹⁰⁾

Que son los cultivos tridimensionales:

Los cultivos tridimensionales son un tipo de cultivos que nos permiten estudiar el desarrollo  y morfología de las células y su interacción entre sí; de igual manera se puede examinar el efecto de sustancias que pueden influenciar en estas interacciones intercelulares. ^(1,4,6)

Realizar el método de cultivos celulares tridimensionales, implica la creación de esferoides agregados que pueden crecer en suspensión o en la parte superior de una matriz 3D; Los métodos de cultivo celular tridimensional se pueden separar en diferentes categorías: método de la gota colgante, método de superficie no adherente y cultivo en suspensión. ⁽¹¹⁾

Los esferoides son un modelo de cultivo tridimensional, el cual saca partido a la manera natural de agregación que muestran muchos tipos celulares, para crear masas de forma esferoidal, que se cultivan de manera in vitro. ⁽¹²⁾

Método de gota colgante: En este método se colocan gotas de suspensiones celulares en la parte inferior de la tapa de una placa Petri. Estas suspensiones se realizan agregando un medio de baja densidad, para que la suspensión quede viscosa. En la base de la placa se añade una solución de PBS para crear un ambiente con un nivel de humedad adecuado. Las células se unen entre sí de manera natural, no dependiendo de matrices ni andamios, por lo que no se necesita el uso de ninguna sustancia que pueda afectar de manera negativa a los esferoides. ⁽¹³⁾

Método de superficie no adherente. Formación espontánea de esferoides: En este método se suelen utilizar contenedores cuya superficie de fondo de la placa ya viene recubierta comercialmente por una capa hidrófila. Este fondo de placa tiene una carga neutra y se une de manera covalente a la superficie de un recipiente de polietileno. Esto provoca que las células no se adhieran a la superficie y por lo tanto permanezcan en suspensión dando lugar a los esferoides en 3D. ⁽¹³⁾

Cultivo en suspensión: La base de este método es colocar una suspensión celular dentro de un contenedor y mantener las células en suspensión mediante agitación o acrecentando la viscosidad del medio añadiendo a este carboximetilcelulosa, un compuesto orgánico derivado de la celulosa. El cultivo en el contenedor puede desarrollarse mediante agitación o rotación continua, esto evitará que las células se adhieran a las paredes del recipiente y facilitará su interacción. ⁽¹⁴⁾

Objetivos:

Los objetivos que se persiguen con este trabajo son principalmente destacar las posibles diferencias entre los cultivos bidimensionales y tridimensionales, enumerar las ventajas de los cultivos tridimensionales y describir la estructura y crecimiento de los esferoides en cultivos 3D, así como nombrar también los distintos usos que se le aplican a este tipo de cultivos en el campo de la medicina y la biología.

Metodología:

Para la realización de este trabajo, se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica, mediante una búsqueda de información científica relacionada con los objetivos planteados anteriormente. Por esa razón, se han realizado consultas en bases de datos, bibliotecas electrónicas, buscadores, como Pubmed, Cochrane, Scielo, redalyc, mediagraphyc, Google académico y libros de ámbito científico con temario relacionado con el tema expuesto.

Resultados:

Diferencias entre cultivos bidimensionales y tridimensionales:

La diferencia fundamental entre los cultivos bidimensionales y tridimensionales,  radica en la forma en la que las células proliferan dentro del cultivo, ya que en los primeros estas se desarrollan en monocapa adheridas a un sustrato plano, o en suspensión flotando en el medio de cultivo, mientras que en los segundos, las células se encuentran sobre andamiajes sólidos pudiendo ser estos naturales o artificiales formando grupos celulares en forma de esferoides o en pequeñas formaciones a modo de cápsulas esféricas llamadas esferas líquidas. En todos ellos, las células se relacionan de manera célula-célula o célula-medio, de modo semejante a como se produce in vivo. ^(6,4)

Ventajas de los cultivos 3D:

En estos cultivos las células se encuentran en completo contacto unas con otras por varias caras a la vez mediante puentes de matriz extracelular. Este contacto entre las células hace que interactúen entre ellas favoreciendo su desarrollo. Otra ventaja es la representación de manera más fiable de las condiciones a las que las células se encuentran sometidas dentro del organismo al que pertenecen. ^(3,10)

Los ratios de crecimiento en los cultivos de células mesenquimales mejoran de manera significativa. ⁽¹⁴⁾

Se producen buenas simulaciones del periodo de suspensión temporal en el crecimiento, desarrollo y actividad física del ciclo biológico e hipoxia en tumores.⁽¹⁰⁾

Pueden reproducirse fácilmente en el laboratorio, siendo una práctica sin mucha complicación a la hora de formar estos cultivos. ⁽¹⁴⁾

Estructura de los esferoides:

En el esferoide podemos diferenciar varias partes. La parte central está formada por células necróticas o apoptóticas, debido a la falta de oxígeno y glucosa, formando un ambiente de hipoxia,  en la zona intermedia nos encontramos células estáticas y en la zona periférica del esferoide, células que se reproducen de forma activa. ⁽¹⁵⁾

Los esferoides poseen una red interna de mucha complejidad y organización en la cual se encuentran relaciones célula-célula y célula-matriz extracelular, donde cada célula tiene diferentes condiciones de espacio, disponibilidad de nutrientes, oxígeno y exposición a otros tipos de estrés físico y químico. Esta heterogeneidad celular es similar a la que se encuentra en las microrregiones avasculares de los tumores. ⁽¹⁵⁾

Diferentes usos de los cultivos 3D:

Los cultivos tridimensionales se han utilizado como modelo para gran número de ensayos terapéuticos experimentales, así como para estudios de la regulación de la proliferación celular, energía y metabolismo de los nutrientes, invasión e interacción entre células y matriz extracelular. Otro uso importante es su práctica para la investigación del desarrollo de tejidos tumorales, el papel de la configuración tridimensional en la expresión génica, el reconocimiento de tratamientos citotóxicos, y el estudio de la introducción de drogas cito-tóxicas, anticuerpos y otras moléculas desarrolladas en ciertas terapias. ^(6,15,17)

Otra utilidad adquirida por estos cultivos es estudiar la multi-resistencia celular, ya que cuando las células se encuentran exhibidas a condiciones de bajo nivel de CO_2, una concentración de nutrientes baja o un ambiente ácido, cambian su expresión génica para lograr su supervivencia. Esto produce a su vez un aumento de la resistencia a gran parte de los medicamentos antitumorales, inmunoterapias e incluso ciertas clases de radioterapias. Los esferoides  son notoriamente destacados en el avance de la creación de nanomedicinas, ya que la entrada del medicamento en los tejidos tumorales puede cambiar debido a las propiedades del vehículo que lo transporta. ^(16,17)

El método del cultivo tridimensional permite las investigaciones in vitro de las interacciones estructura-función celular tanto en situaciones de normalidad como en situaciones patológicas; también permiten estudios de los factores de crecimiento, citoquinas, los componentes de la matriz extracelular entre otros, tanto para el análisis de la relación que generan las células y los distintos agentes expulsados al medio como para el diagnóstico clínico. ⁽¹⁸⁾

Conclusión:

A día de hoy y gracias a las ventajas ofrecidas para la realización de estudios en tejidos animales, los cultivos celulares tienen una importancia muy relevante en gran cantidad de áreas de la investigación científica.

Los esferoides multicelulares se encuentran más cercanos a la recreación de las diferentes propiedades bioestructurales y biofuncionales celulares de los cultivos de células de tejido in vivo, que las celular cultivadas en monocapa en los cultivos en 2 dimensiones. Esta diferencia a promovido el desarrollo de ciertas técnicas de cultivo producido por un aumento en la producción, alta calidad y rendimiento de estos cultivos celulares. ⁽⁶⁾

Añadir a estos cultivos bidimensionales la tercera dimensión supone introducirnos  en un mundo nuevo y diferente de la investigación in vitro, ya que implica un cambio en la expresión de genes, en la producción de proteínas, y en la forma y las interacciones celulares, es decir nos planteamos una situación completamente nueva en cuanto a cómo se diferencian, proliferan, interactúan y sobreviven las células en cultivo. ⁽¹⁸⁾

Como conclusión final, destacar la importancia en la evolución de estos métodos de cultivo, ya que el uso de los cultivos 3D permiten concluir que las condiciones de mantenimiento de las células, según dichos modelos, se asemejan de manera importante a las encontradas en el interior del organismo vivo, y eso puede favorecer la visualización del comportamiento de dichas células ante la infiltración de ciertos medicamentos pudiendo llegar a obtener grandes resultados en las investigaciones realizadas sobre distintos tipos de enfermedades.

Bibliogragía:

1. libro: cultivos de células animales y humanas. Aplicaciones en medicina regenerativa. Autores: Pablo E. Gil-Loyzaga. Editorial Visión Libros. Páginas: 50-150.
2. Libro: Biología Celular y Molecular. Autores: Harvey Lodish,Arnold Berk,Chris A. Kaiser,Monty Krieger,Anthony Bretscher,Hidde Ploegh, Angelika Amon,Matthew P. Scott. Ed :7ª. Editorial: Panamericana.
3. Ravi M, Paramesh V, Kaviya SR, Anuradha E, Solomon FD. 3D cell culture systems:         advantages and applications. J Cell Physiol. 2015;230(1):16–26. doi:10.1002/jcp.24683

4. Libro: culture of animal cells. A manual of basic technique. R. IAN FRESHNEY. Alan R. Liss, inc. New york.

5. Sato JD, Hayshi I, Hayashi J, Hoshi H, Kawamoto T, McKeehan WL, et al. Specific cell types and their requeriments. En: Davis JM, ed. Basic cell culture: a practical approach. Oxford: Oxford University Press;1994.p.181-222.

6. Información recopilada a partir de la página: http://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/cultivo_celular.pdf

7. Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de células animales). Autores: Lic. María Eugenia Segretín. A partir de la página: http://www.argenbio.org/adc/uploads/imagenes_doc/cultivos%20celulas/Cultivos%20celulares%20I%20Euge.pdf

8. Optimización de cultivos de hepatocitos humanos para estudios de citotoxicidad. Patricio Cabané T., Juan Carlos Díaz J., Jorge Rojas C., Fernando Maluenda G. Guillermo Rencoret P., Katherine Saud L., M. Loreto Godoy V., Daniela Acache A., Alejandra Ledezma S. Raúl Caviedes C. y Pablo Caviedes F. A partir de la página: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?pid=S071840262007000200006&script=sci_arttext

9. Aspectos ingenieriles del cultivo in vitro de células vegetales para la producción de metabolitos secundarios: Mario Arias, Ana Aguirre, Mónica Angarita, Carolina Montoya, Juan Restrepo. A partir de la página: https://www.redalyc.org/pdf/496/49611942011.pdf
10. Haycock JW. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 2011;695:1–15. doi:10.1007/978-1-60761-984-0_1
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17. Esferoides tumorales multicelulares en la evaluación de estrategias terapéuticas anticancerosas. Juan Carlos Gallardo Pérez, Magali Espinosa Castilla, Jorge Meléndez Zajgla y Vilma Maldonado Lagunas. A partir de la página:https://www.medigraphic.com/pdfs/revedubio/reb-2006/reb064b.pdf
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